第四章 分子育种技术

传统育种的全部工作，说到底都在田间完成：种下去、长出来、看表现、做选择。这种方法行之有效，却有两个绕不开的局限——一是慢，哈密瓜一年一熟，改良性状动辄五六年；二是看不准，许多性状的表现深受环境影响，凭眼睛作出的判断未必可靠。分子育种正是冲着这两个局限来的：把选择的依据从田间表型转到实验室里的DNA，把”看得见”变成”看得准”。

当然，分子育种并非取代传统育种，而是为它配备更精良的侦察工具。从发展脉络上看，这门技术经历了几个层层递进的阶段：先有分子标记，让育种者能够”跟着基因走”；再有基因定位与克隆，弄清基因在什么位置、是什么基因；进而借助基因组学把全基因组的信息摊在桌面上；然后基因编辑让育种者从”利用现成变异”走向”按设想创造变异”；最后基因组选择和智能设计育种把这些手段整合成一套面向数量性状和整体决策的体系。每一阶段都不是前一阶段的替代，而是在其基础上的扩展。

本章按由浅入深的顺序展开：先讲分子标记这一最基础的工具，再讲基因定位与克隆、基因组学与转录组学、基因编辑，最后是基因组选择和智能设计育种。全部讨论都围绕一个落点：这些技术怎样与哈密瓜育种的 real 问题——抗白粉病、果肉颜色、糖分积累——真正接上头。

4.1分子标记技术

分子标记的本质，是在DNA水平上找到可以稳定检测的遗传差异并当作”路标”来用。植株的高矮、果实的甜度会随年份、地块、栽培措施而变，DNA序列的差异却终生不改、代代相传——正是这种稳定性，使分子标记成为追踪基因的可靠坐标。理想的标记应当多态性高、重复性好、操作简便、成本低廉，但现实中没有哪种标记能同时占全这些好处，于是多种标记长期并存、各司其职。本节先回望标记技术的演进脉络，再逐一介绍当前主流的几类标记，最后落到育种家最关心的应用——分子标记辅助选择。

4.1.1从RFLP到功能标记：技术演进的基本逻辑

分子标记的历史，大体是一部”检测手段不断简化、通量不断提高”的历史。最早登场的是RFLP（限制性片段长度多态性）标记。它的原理是：DNA序列的差异会改变限制性内切酶的切点位置，酶切后的片段经电泳分离、探针杂交，就能显现出个体间的差异。RFLP的优点是稳定可靠、呈共显性遗传，在上世纪八九十年代曾是构建首批作物遗传图谱的主力；但探针制备繁琐、一次只能检测一个位点、还需要放射性同位素或荧光标记，很快就被后续技术边缘化。对哈密瓜研究而言，RFLP时代的意义主要在于方法论——它证明甜瓜基因组的标记作图是可行的，留下了最早的一批图谱骨架。

取而代之的是以PCR为基础的第二代标记，其中在甜瓜上应用最广的是SSR（简单重复序列，又称微卫星）标记。基因组中的SSR位点是几个核苷酸（如CA、ATT）串联重复的区段，重复次数在个体间常有变化，用两侧保守序列设计的引物扩增后，片段长短的差异便一目了然。SSR之后，InDel（插入缺失）标记和SNP（单核苷酸多态性）标记相继进入舞台，它们与SSR一起构成了当前哈密瓜分子研究的主力，具体特点下一目再谈。

第三代标记通常指直接源于功能基因序列变异的标记。前述标记检测的大多是基因组中的”中性”变异，它们与性状基因之间只有连锁关系，靠得再近也可能在重组中”脱钩”。功能标记则直接建立在决定性状的基因位点本身——比如已克隆基因内部的因果SNP——因此与性状完全共分离，选择时不会走眼。功能标记的前提是基因已被克隆、功能变异已被查明，数量有限，却是标记技术的理想归宿。这条演进线索可以概括为：从检测随机变异到检测因果变异，从连锁追踪到直接识别。

纵观三个阶段，推动技术更替的动力始终是育种实践的需求：图谱构建阶段要求标记多态性好、共显性遗传；大规模基因分型阶段要求通量高、成本低；到了设计育种阶段，则要求标记直接命中功能位点。理解了这条主线，就不难理解下文各类标记为何如此分工。

4.1.2主流标记的特点与应用

在哈密瓜研究中，SSR、SNP和InDel三类标记构成了当前的工作主力，它们的”技术档案”如下：

SSR标记：

• 特点：共显性、多态性高、重复性好

• 应用：遗传多样性分析、品种鉴定、QTL定位

• 数量：已开发5000+对SSR引物

SSR的优点相当全面：共显性遗传能区分纯合与杂合，多态性高意味着分辨力强，重复性好则保证不同实验室的结果可以互相印证。五千多对引物的储备，为构建遗传图谱、分析亲缘关系、开展QTL定位打下了扎实基础，多年来是哈密瓜分子研究中使用最广的标记，短板只在通量——逐对引物做PCR再跑胶，规模一大就力不从心。

SNP标记正好补上这个缺口：

SNP标记：

• 特点：高通量、自动化、成本低

• 检测平台：KASP、TaqMan、GBS

• 应用：全基因组关联分析（GWAS）、基因组选择

基因组里SNP的数量远比SSR丰富，KASP、TaqMan把单个位点检测成本压得很低，GBS更是一次可得数十万个位点，GWAS和基因组选择正以此为前提。三个平台各有定位：KASP适合把少量经过验证的位点做成”成品标记”，在大批量育种材料上做基因分型，一次反应一个位点、成本极低、结果判读全自动化；TaqMan类似，用荧光探针判型，常用于质量控制和商业化检测；GBS（简化基因组测序）则是对基因组做限制性酶切后只测表达”抽样”的那一部分，适合从头挖掘大量SNP，是构建高密度图谱和开展GWAS的常用起点。实际工作中常见的搭配是：精细分析和品种鉴定用SSR，大规模分型用SNP。

InDel标记则介于两者之间：

InDel标记：

• 特点：共显性、易于检测

• 应用：基因分型、品种纯度鉴定

InDel是基因组中小片段的插入或缺失，检测简单直观，常用于品种纯度鉴定——制种田里混没混进杂株，几个位点一验便知（详见第九章）。

为便于对照，表4-1把四类标记的技术特征汇总如下。需要说明的是，表中比较只反映一般情形，具体到一个实验室选什么标记，还要结合设备条件、经费规模和试验目的来定。

4.1.3分子标记辅助选择（MAS）

有了标记，就可以开展分子标记辅助选择（MAS）。MAS的道理说来简单：标记若与目标基因紧密连锁，苗期一片叶子提DNA就能判定去留，不必等植株长成、不必人工接种。这套流程跑通的前提，是先开发出合用的标记——通常的做法是：在候选基因附近或内部找到与性状稳定关联的变异，设计成便于检测的SSR或KASP标记，再用分离群体和多年多点试验验证其可靠性，确认无误后才投入育种应用。标记开发的投入不小，但一个可靠标记可以服务整个育种周期，摊薄下来往往比反复做田间接种鉴定更经济。

进入应用环节后，MAS的选择策略主要有三个层面：

分子标记辅助选择（MAS）：

• 前景选择：目标基因标记

• 背景选择：全基因组标记

• 重组选择：目标基因两侧的交叉位置

前景选择盯住目标基因本身，回答”有没有”的问题；背景选择用遍布全基因组的标记考察遗传背景，回答”除了想要的，还带进来多少不想要的”；重组选择则瞄准目标基因两侧的染色体区段，通过选留目标区段附近发生重组的个体，把供体片段压缩到最小。三者分工不同，又常常配合使用——经典的做法是在回交转移抗病基因时，每一代都做前景选择保证抗性不丢，同时做背景选择加快遗传背景向轮回亲本的恢复，再辅以重组选择缩短供体片段。多重标记配合之下，传统回交要六到八代才能完成的背景恢复，往往三到四代即可实现，且目标区段的”拖泥带水”要少得多。

不过也要清醒：MAS的全部威力都建立在”标记与基因连锁足够紧”这一前提上。连锁不够紧，选择就会走眼——表型有抗性而标记未检出，或标记检出而表型无抗性，这样的返工教训在早期实践中并不少见。正因如此，严谨的标记开发必须包括大群体验证和不同遗传背景下的检验，赶工期的”半成品标记”宁可不用。

4.1.4MAS与哈密瓜育种的实际结合

品种鉴定和杂种纯度检验是MAS另一块容易被忽视却效益直接的应用阵地。哈密瓜杂交制种规模逐年扩大，杂株混入、亲本不纯造成的经济损失动辄以整批种子计；用十几个多态性SSR或InDel位点建立主要品种的指纹档案，一份种子是否正宗、一批制种纯度是否达标，实验室当天即可出具结论，比田间种植检验快出一个生长季以上。这项工作技术门槛不高，却是分子育种中最”解渴”的日常应用，不少育种单位正是从这里开始建立自己的分子实验室的。此外，指纹数据长期积累下来，还服务于品种权保护——纠纷发生时，DNA证据比任何描述都硬。

MAS最有代表性的应用是抗病性的转育。Fom-2基因（抗枯萎病）的MAS育种是最经典的案例——枯萎病的田间接种鉴定费工费时、受土壤条件干扰大，分子标记苗期一次筛选，效率不可同日而语。哈密瓜抗白粉病育种中MAS的作用同样突出：白粉病是新疆设施栽培中危害最重的叶部病害，田间抗性鉴定受发病条件制约，结果不稳定；而从PI 414723、MR-1等抗源（见第一章）向栽培品种转育抗性时，回交群体中单株是否携带抗性基因，苗期分子检测即可判定，回交进程因此大为提速。对一年一熟、世代更替缓慢的哈密瓜而言，MAS每省下一个世代，就意味着缩短一年周期，这是它最实在的价值。

品质性状方面，MAS也在逐步落地。果肉颜色、果皮特征等由主效基因控制的性状，已有可靠的连锁或功能标记可用，在杂交后代中做早期筛选，可以免去大量不必要的果实测定；糖分这类数量性状则难以指望单个标记，需借助基因组选择等手段（见5.5节）。还应指出，MAS选择的是”基因型”，并不直接保证”表现型”——抗性基因有没有表达、表达程度如何，最终仍要在田间核实。比较明智的用法是把MAS当作田间鉴定的前置过滤器：先用标记把群体筛掉一大半，再对留下的少数材料做精细的表型评价，两者相加的效率远高于任何单一手段。

4.2基因定位与克隆

标记解决的是”跟着走”，定位与克隆回答的则是更深一层的疑问：控制性状的基因在基因组什么位置、是什么基因、怎样起作用。把这些问题弄清，育种就从凭经验上升为有图纸。本节沿”构建图谱—定位QTL—克隆基因—关联分析”的顺序展开，这也是传统上基因挖掘由粗到细的完整链条。

4.2.1作图群体与遗传图谱构建

遗传图谱的原理并不深奥：减数分裂中同源染色体之间的交换频率与两个位点间的物理距离大体成正比，只要统计大量后代中标记间重组发生的频率，就能推算出它们的相对位置，把一条条染色体”画”成一张图谱。图谱是QTL定位和图位克隆的基础设施，而图谱的质量首先取决于作图群体的选择。

QTL定位：

• 群体类型：F2、BC1、RIL、DH

• 作图软件：JoinMap、MapQTL、R/qtl

四类群体各有短长。F2和BC1构建容易，亲本杂交当年即可获得，适合快速上手，但它们属于”一次性”群体——个体自交或繁殖后遗传组成即发生改变，无法多年多点重复鉴定，而数量性状恰恰最需要多年数据来压低环境噪声。RIL（重组自交系）通过连续自交使每个株系近乎纯合，DH（双单倍体）经花药培养一步纯合，两者都能无限扩繁、长期保存，是数量性状定位的理想材料；代价是构建周期长，RIL通常需要六到八个自交世代，DH则依赖花培技术效率——葫芦科作物花培成功率偏低，DH群体的构建在哈密瓜上并非易事。实践中比较经济的做法是”先用F2出初步结果，再补建RIL做精细定位”。

图谱构建软件以JoinMap为代表，QTL分析常用的MapQTL、R/qtl等都是这一领域的成熟工具。软件操作并不复杂，真正费心思的是群体设计和数据质量：亲本间差异要足够大（否则无多态可作图）、群体要足够大（否则图距估计粗糙）、基因分型数据要反复核对（个别错判足以扭曲整条连锁群）。哈密瓜的SSR图谱经过多年积累已相当完备，SNP时代的GBS作图更把标记密度提升了一个数量级，这些图谱既是本节成果，也是后续定位工作的坐标纸。

4.2.2QTL定位

遗传图谱建好后，就可以把控制数量性状的染色体区间逐个”钉”到图谱上，这就是QTL（数量性状位点）定位。其统计框架是：在分离群体中同时记录每个个体的标记基因型和性状值，检验每处标记附近是否存在与性状值显著关联的区间——若携带某一标记等位基因的个体平均值系统性偏离另一些个体，就有理由相信该标记附近存在影响这一性状的位点。分析方法从单标记检验到区间作图、复合区间作图逐步改进，核心思路都是排除背景基因型的干扰、提高定位精度。

还需要提醒几条实践中的常见陷阱。其一是QTL与环境互作：同一个QTL在这块地、这个年份效应明显，换个条件可能消失，因此正式的定位研究必须多年多点重复鉴定，单年单点检出的QTL只能算线索。其二是QTL间的互作（上位性）：两个位点单独看效应平平，组合起来效应显著，这类位点用常规区间作图容易漏检，需要的样本量也更大。其三是阈值选择：过松则假阳性泛滥，过紧则真位点漏网，惯例是同时报告显著阈值和提示性阈值两档结果，分别对待。这些细节决定了QTL定位结论的可信度，也决定了由它转化来的MAS标记是否真的好用。

哈密瓜可溶性固形物含量（SSC）的QTL定位是很好的例子：

• 案例：SSC的QTL定位（SSC1.1、SSC3.1、SSC8.1）

主效QTL分布在三条染色体上，单个QTL对性状变异的解释率有限，且效应大小随环境、年份波动。这个结果印证了两件事：其一，糖分是典型的多基因数量性状，指望单个主效基因一锤定音并不现实；其二，QTL命名的”染色体.编号”体系（如SSC1.1即1号染色体上的第一个SSC位点）为跨研究的比较提供了统一语言，同一QTL在不同群体中被反复检出，其可靠性就大大增强。对育种者而言，QTL定位的直接产出是连锁标记——把解释率较高的QTL转化为MAS标记，即可用于早期选择；间接产出则是对性状遗传架构的判断，它决定了后续该走MAS、基因组选择还是两者结合的路线。

4.2.3图位克隆

QTL给出的是一段区间，要落到具体基因还需要图位克隆（亦称基于图谱的克隆）：

图位克隆：

• 步骤：精细定位→候选基因筛选→功能验证

• 案例：CmOr基因克隆（控制β-胡萝卜素积累）

还应看到，图位克隆的”下游价值”往往超过克隆本身。基因到手之后，第一层利用是开发功能标记，供MAS直接使用，如前所述；第二层是作为基因编辑的靶点，编辑所需的靶点序列信息、功能变异知识，全部来自克隆工作的积累，CmOr正是先经克隆、后成编辑靶点的完整示范；第三层是机理研究，基因所参与的代谢或信号通路一旦查明，常常牵出一串新的候选基因，为下一轮克隆提供线索。三者叠加，使图位克隆成为连接定位研究与实际育种的枢纽环节——费在前期，收在长期。

图位克隆走”先定位、后分离”的路子。第一步精细定位，用极大群体（常达数千株）和加密标记把目标区间收窄到几十甚至十几个kb；第二步在缩小的区间内注释并筛选候选基因，依据表达模式、序列变异与表型的对应关系圈定对象；第三步功能验证，通过转基因互补、基因敲除等手段确认”改了这个基因、性状随之改变”，才算坐实。整个流程历时数年，投入可观，但克隆到的基因是真正的”硬资产”——由此可开发功能标记，可作基因编辑靶点，性状改良从此有的放矢。

CmOr的克隆是甜瓜上的公认范例。这一基因控制果肉中β-胡萝卜素（维生素A前体）的积累，橙色果肉与白色果肉的差别由此基因的变异决定；CmOr的阐明不仅解释了橙果肉甜瓜的分子基础，还为果肉颜色性状的分子设计提供了确切靶点，后来的基因编辑研究正是循此靶点展开的（见5.4节）。类似的克隆工作还在糖分、抗病等性状上不断推进，每克隆一个基因，哈密瓜育种可用的”零件库”就扩充一分。

4.2.4全基因组关联分析（GWAS）

图位克隆历时数年，关联分析则提供了更快捷的路线：

关联分析：

• GWAS：自然群体、高密度SNP

• 案例：果实品质性状的GWAS分析

GWAS直接利用自然种质群体，凭高密度SNP扫描全基因组寻找关联位点，省去建群体这最耗时的一步；由于自然群体经历了漫长历史积累的重组，关联定位的精度通常也比双亲群体更高——检出的信号区间往往更窄，候选基因更少。甜瓜果实品质性状的GWAS分析近年成果颇丰，糖分、果色、果形等性状的关联位点不断见诸报道，与QTL定位的结果互相印证。

但GWAS的统计陷阱也格外多，初学者不可不察。首要的是群体结构造成的假阳性：种质群体由不同来源的材料拼合而成，亲缘远近不一、亚群分化明显，如果某亚群恰好性状值偏高，那么体现亚群来源的标记就会与性状”虚假关联”——明明不存在的基因，统计上却表现得像模像样。对策是混合线性模型，把群体结构（主成分分析所得）和个体亲缘关系（亲缘系数矩阵）作为协变量纳入模型，这也是现代GWAS软件的标准配置。其次是多重检验问题：几十万个位点逐一检验，即使毫无真实关联，按概率也必然出现成千上万的”显著”结果，故须用严格的阈值校正加以控制。第三是统计功效与标记密度的权衡——GBS的”抽样”性质可能漏掉某些位点，导致真实基因检测不到（假阴性），结果虽不像假阳性那样引人注目，同样影响结论的完整。

判读GWAS结果时，还有几个实用经验：看QQ图（观察线偏离理论对角线是否集中于头部，判断群体结构校正是否到位）、看效应大小（统计显著而效应极小的位点，育种价值有限）、看可重复性（换个群体是否还能检出）。GWAS与QTL定位、后续的基因克隆构成互相校验的证据链，单凭一张曼哈顿图就下结论，是关联分析研究中最常见的失误。

4.3基因组学与转录组学

前面的标记和定位处理的都是单点问题，要把育种决策放到全基因组高度，就需要更系统的数据平台。2012年甜瓜参考基因组的发表是个分水岭，从此哈密瓜分子研究才真正具备”读透全书”的条件。本节按”基因组—转录组—代谢组”的层级展开，三者分别回答”有什么””用没用””产出了什么”三个问题。

4.3.1参考基因组与重测序

基因组测序：

• 参考基因组：C. melo cv. DHL92（2012年）

• 基因组大小：~450 Mb

• 基因数量：~27,000

以DHL92为材料的参考基因组，第一次把甜瓜约450 Mb、两万七千个基因的家底摊在桌面上。这份”全基因组地图”的价值怎么估计都不过分：此后设计引物、注释QTL区间、开展重测序比对，都要以它为坐标；GWAS检出的关联区间里到底有哪些基因，也要靠它的注释信息来判断。对哈密瓜研究而言，参考基因组提供的还有一套框架效应——任何一个新测序材料，都天然获得了与所有已有研究成果”对表”的可能。

顺带说一句测序技术本身。2012年那版参考基因组基于第二代短读长测序，对重复序列和结构变异的解析能力有限；此后单分子长读长测序（三代测序）陆续投入甜瓜基因组研究，装配出连续性更高的新版本，转座子密集区、着丝粒附近等”难啃”的区域被逐步补齐，基因注释也随之更新。对育种者来说不必纠结版本更替的技术细节，只需记住两点：其一，引用基因组坐标时注明所依据的版本，不同版本的基因编号并不通用；其二，结构变异——大片段的插入、缺失、倒位——正随着长读长技术进入研究视野，这类变异在园艺作物的性状分化中可能扮演重要角色，是值得留意的方向。

有了参考基因组，对更多材料重测序便顺理成章：

重测序：

• 群体规模：100-1000份种质

• 应用：群体结构、选择信号、GWAS

对上百份乃至上千份种质逐一测序，可以摸清群体里有哪些变异、材料间亲缘几何；比较驯化材料的基因组，还能检测出承受强烈选择压力的区域——被”筛过”的区域往往正是控制农艺性状的基因所在，等于给基因挖掘画出了重点。就哈密瓜而言，重测序数据的另一个直接用途是检验第一章谈到的起源演化问题：分子层面的群体结构分析，把新疆地方品种与中亚厚皮甜瓜的亲疏关系刻画得越来越清晰，为资源的归类利用提供依据。随着测序成本持续下降，百份级重测序已从”奢侈手段”变成大资源研究的常规操作，这也是GWAS在甜瓜上快速发展的直接推手。

4.3.2转录组学

基因组回答”有什么”，转录组学回答”什么时候用”：

转录组学：

• RNA-seq：果实发育、抗病响应

• 案例：果实成熟过程中的基因表达谱

RNA-seq测定特定组织、特定时期的基因表达。比较果实不同发育阶段的转录组，可以把糖代谢、香气合成基因的表达动态刻画出来——哪些基因在坐果后表达骤升，哪些在成熟期被激活，一比对便知。这类表达谱好比给静态的基因组拍了一段动态影像，静态的基因序列告诉不了育种者”何时何地起作用”，转录组补上的正是这一维。抗病响应研究也大量借助转录组：接种病原菌后Comparing感病与抗病品种的基因表达变化，可以锁定响应通路的枢纽基因，为抗病机制的解析和抗病候选基因的筛选提供线索。

实践中转录组数据的用法通常是”缩小包围圈”：GWAS或QTL定位给出几十个候选基因后，转录组数据用来回答”其中哪些在目标组织、目标时期高表达”，一圈筛下来候选名单常常只剩几条。多组学互相搭台的分工格局，正是在这种配合中形成的。

4.3.3代谢组学与多组学整合

基因表达的最终产出是代谢物，于是有了代谢组学的补充：

代谢组学：

• GC-MS：香气物质

• LC-MS：糖分、有机酸

• 整合分析：转录组-代谢组关联

香气物质挥发性强，适合GC-MS（气相色谱-质谱）检测；糖分有机酸多用LC-MS（液相色谱-质谱）。哈密瓜的风味品质最终由这些代谢物的组成和比例决定，代谢组学因此是连接基因与”好不好吃”的最短一环。单看代谢物只能知其然，把转录组与代谢组关联起来才可能知其所以然——某个香气成分的品种间差异，追溯到哪个酶基因的表达差异，这条因果链一旦打通，代谢组学就成了连接基因与品质表现的桥梁，也是第五章将反复用到的思路。

这里还想强调一个常被轻视的问题——数据的规范积累。组学分析的一次性成果容易发表，可比较、可累积的数据资产却难得建立：样品编号对不上、年份地块没记录、测定方法随人员更替而变化，都会让多年积累的数据丧失二次利用价值。国内外开展智能育种较早的单位，无一例外都从建立统一的试验记录规范和数据管理系统起步。对刚起步的哈密瓜育种团队而言，与其急着买设备跑流程，不如先把”每一份材料的来历、每一次测定的条件”记清楚——这是所有上游分析的根基，也是本书建议读者养成的第一习惯。

当然，整合分析说易行难：转录组和代谢组都是”高维”数据，变量数远超样本数，直接做关联容易收获一堆统计假象。比较稳妥的路线是带着假说去找——先从代谢物差异出发，再到转录组里查相应通路的基因，而不是放任数据自己”讲故事”。数据整合是智能设计育种（5.6节）的基础工程，此处先立其骨架。

4.4基因编辑技术

此前的技术再精巧，本质上都是在利用自然界已有的变异。基因编辑跨出了一大步：育种者可以按设想直接在基因组上修改指定碱基。如果说传统育种是”选书”，MAS是”索引”，基因编辑就是”改稿”。本节先讲CRISPR/Cas9的基本原理与哈密瓜上的应用，再谈载体构建与葫芦科作物特有的落地难点，最后介绍更精细的新一代编辑技术与脱靶问题。

4.4.1CRISPR/Cas9系统的原理与哈密瓜中的应用

CRISPR/Cas9原是细菌对抗噬菌体的免疫系统，被改造为基因组编辑工具后，其核心组件只有两个：向导RNA（sgRNA）和核酸酶Cas9。sgRNA前段约二十个核苷酸与目标序列互补配对，把Cas9″导航”到基因组特定位点；Cas9在靶点上游的PAM序列（对常用的SpCas9而言为NGG）处切开DNA双链。细胞随后启动自身的修复机制，非同源末端连接的修复方式粗糙易错，往往在切口处留下几个碱基的插入或缺失，造成阅读框移码、基因功能丧失——这就是敲除的原理。若同时提供一段修复模板，细胞可借同源重组按模板精确修复，从而实现定点替换，只是效率低得多。

CRISPR/Cas9系统：

• 靶基因：CmOr、CmSUS、CmPG

• 应用：品质改良、抗病性增强

• 案例：CmOr基因敲除导致β-胡萝卜素积累减少

在甜瓜上，编辑研究已覆盖多个靶基因。CmOr敲除案例很说明问题：敲除后果肉β-胡萝卜素明显减少，与图位克隆的结论互为印证——两条独立路线给出一致答案，既坐实了CmOr的功能，也演示了定向改造品质性状的可能性。CmSUS（蔗糖合酶）、CmPG（多聚半乳糖醛酸酶）这些糖代谢与细胞壁代谢的关键基因，同样是热门靶点：前者关系糖分积累，后者影响果实质地与软化，敲除或改造它们，分别对应着增糖和耐贮运两个育种方向。抗病性增强方面，利用编辑使感病基因失活或改造病原识别相关位点，也是正在探索的路线。

值得注意的是，编辑结果的解读需要一点遗传学常识：若目标性状由显性等位基因决定，敲除使其失活往往改变性状；若由隐性等位基因决定，敲除显性等位基因反而可能”获得”隐性性状。设计靶点之前，先弄清性状的遗传方向，是编辑实验的基本功。

4.4.2载体构建与哈密瓜基因编辑的一般难点

一个典型的植物CRISPR实验，从载体构建开始。常用载体把Cas9和sgRNA安排在同一T-DNA区段：Cas9编码序列由组成型启动子驱动，sgRNA由植物U6或U3启动子驱动；载体经农杆菌介导转入愈伤组织或外植体，筛选获得再生植株后再检验编辑效果。看似流程清晰，落到哈密瓜上，每一步都有门槛。

第一个难点是基因型的差异。甜瓜品种间再生能力和转化效率参差悬殊，实验室里转化效率高的模式基因型，往往园艺性状平庸，其编辑成果要走向品种还须经历漫长的杂交回交；而主栽哈密瓜品种的稳定转化体系建立尚不成熟，这是目前编辑研究多以模式材料先行的主要原因。第二个难点是靶点设计：编辑效率与sgRNA序列关系极大，同一基因多个候选靶点的活性可能相差悬殊，设计时既要保证与目标序列完美匹配，又要预判PAM的可得性，经验积累仍不可少。第三个难点是嵌合体与纯合鉴定：T0代植株的编辑常常只发生在部分细胞，需要在后代中继续分离筛选，配子体编辑效率低时工作量成倍增加。对一年一熟的哈密瓜，从转化到获得纯合编辑系，走完全程通常要数年，编辑本身虽快，后代的纯合固定仍受世代更替的硬约束。

还有一层现实约束来自育种目标本身：哈密瓜最要紧的品质性状（糖分、香气、网纹）多属数量性状，受许多基因共同控制，逐个敲除微效基因既无效率也无必要。更合理的期待是把编辑用在该用之处——主效基因控制的性状（如果肉颜色）、已知功能变异的等位基因替换、抗病基因位点的定向改造，与基因组选择等数量性状工具形成分工。

4.4.3碱基编辑、引导编辑与脱靶问题

在敲除之外，编辑技术还在朝更精细的方向发展：

碱基编辑：

• 胞嘧啶碱基编辑器（CBE）

• 腺嘌呤碱基编辑器（ABE）

• 应用：单碱基突变

编辑效果怎么”看”，也是实验设计的必修内容。初步筛查可用错配酶法（如T7E1）或限制性酶切法快速判断靶点是否发生突变，这类方法便宜快捷，但分辨不出具体突变类型；要确定突变是几个碱基的插入还是缺失，最终仍要靠靶点PCR产物测序。近年发展出基于二代测序的高通量突变检测，一次可核查数百个样本，配合脱靶位点测序，构成完整的编辑效果评价链条。经验法则是：粗筛用快方法锁定高编辑效率的处理，精测用测序法确认突变细节，两条腿走路，工作量与经费才能兼顾。

碱基编辑不制造双链断裂，而是把经过改造的Cas9变体（切口酶形式）与脱氨酶融合，在单链暴露的窗口区内直接把C转换为T（CBE）或把A转换为G（ABE）。它特别适合点突变类型的改良——许多优异与劣质等位基因的区别不过一两个碱基，”改一个字母”即可转化，既避免了双链断裂带来的不确定修复，也不需要修复模板。

引导编辑进一步扩展了可编辑的范围：

引导编辑：

• 先导编辑（Prime Editing）

• 应用：精确插入、缺失、替换

Prime Editing利用特殊设计的向导RNA（pegRNA）携带所需序列信息，理论上可完成小片段的精确插入、缺失和任意替换，是目前自由度最高的编辑方式。不过要坦率指出，这些前沿技术要在哈密瓜上落地还有一段路——葫芦科作物遗传转化和再生效率偏低，编辑载体递送就是现实的瓶颈；碱基编辑和引导编辑在甜瓜上的成功案例也还有限，从”原理可行”到”育种可用”之间隔着效率、稳定性和转化体系三道坎。

最后是脱靶问题。sgRNA与非目标序列的部分相似可能导致Cas9″误伤”别处，产生计划外的突变。评估和控制脱靶的手段包括：设计时规避与基因组其他区域高度相似的靶点、编辑后对潜在脱靶位点测序验证、必要时借助全基因组重测序做全面排查。对以食用为目的的作物，脱靶的排查更是安全评价的必答题——这个问题与基因编辑产品的监管定位交织在一起，是任何编辑育种项目立项前都要想清楚的事，相关监管框架下一段即作交代。这里只需记住一条：脱靶不可怕，不查才可怕。

4.5基因组选择

MAS擅长追踪一两个主效基因，而产量、糖度这类由大量微效基因决定的性状，单靠少数标记必然挂一漏万。基因组选择换了思路：用遍布全基因组的几万个标记一起建模，估计每个标记的效应，再据此预测个体的遗传价值。这一思想由动物育种提出并率先大规模应用，随后迅速扩展到作物，对世代周期长、表型鉴定昂贵的园艺作物尤其对症。

4.5.1统计模型思想

基因组选择的核心假设是：数量性状的遗传变异分布于全基因组的大量位点上，只要把所有标记的效应都估计出来，个体的遗传价值就是各标记效应之和。不同模型的差别，在标记效应先验分布的假设上：

原理：

• 利用全基因组标记预测个体育种值

• 模型：GBLUP、BayesA、BayesB、机器学习

GBLUP（基因组关系矩阵BLUP）假定所有标记都是微效，把标记信息汇总成一个基因组亲缘关系矩阵，套用经典的混合模型框架求解。它简便通用、数值稳定，是事实上的基准模型，多数新方法都以它为对照。BayesA、BayesB等贝叶斯方法则允许部分标记效应较大——BayesB进一步假定大多数标记效应为零、少数标记承担主要效应，更贴近”主效+微效”的遗传架构，在效应集中时预测精度可占上风，代价是计算量大、参数敏感性高。机器学习方法近年也开始进入这一领域，在非线性关系和基因型-环境互作的刻画上显示出潜力，但”黑箱”程度高、可解释性弱，实际应用仍以GBLUP和贝叶斯模型为主。模型如何选，要看性状遗传架构和数据规模，实践中交叉验证后再定——用一部分数据建模、另一部分数据检验，预测准确度最高的模型胜出，这是最可靠的选型依据。

4.5.2训练群体与预测准确度

基因组选择不是”一次建模、终身受益”的技术，它的成效首先取决于训练群体——即那批同时具备基因型和表型数据、用来估计标记效应的材料。训练群体的设计有几个要点：一是代表性，训练群体与待预测的候选群体之间要有足够的亲缘关系，用外群数据预测本群个体，准确度往往大幅缩水；二是规模，训练群体越大、标记效应估计越准，一般而言数百个个体是起步规模，遗传力低的性状所需样本更多；三是表型质量，表型鉴定是训练数据的地基，多年多点、设置重复的数据能显著提升模型质量，再精巧的算法也救不了粗糙的表型。

预测准确度的影响因素可以归结为几条：性状遗传力（遗传力越高越好预测）、训练群体大小与亲缘关系（越大越近越好）、标记密度（高到足以覆盖LD衰减距离即可，盲目加密收益递减）、以及训练与预测环境的一致性——G×E互作强时，在一种环境下训练的模型换到另一种环境往往需要重新校准。这些因素共同提示：基因组选择是系统工程，建模只是其中一环，实验设计、表型平台和数据管理同样是决定成败的变量。

4.5.3在哈密瓜育种中的应用

基因组选择的真正价值体现在对育种进程的压缩上：

应用：

• 早期选择：幼苗期预测成株性状

• 缩短育种周期：从6-8年缩短至3-4年

• 案例：SSC、单果重的基因组选择

落实到操作层面，基因组选择在育种程序中的嵌入方式大体是：在基础群体（如多个亲本的杂交组合后代）上同步采集基因型和表型，建立或更新训练模型；从第二年起的早期世代（如苗期或低代分离群体），只做基因分型并按基因组估计育种值排序，保留排名靠前的个体进入下一世代；到高代品系阶段再恢复全面表型鉴定，用于品种决选和模型校准。这样安排的好处是：昂贵的表型鉴定集中在少数最优秀的材料上，而大量平庸个体在苗期即被筛除，田间面积、人工和管理成本都随之下降。世代循环中模型也随新数据不断更新，预测能力逐年增强——这正是它作为”育种基础设施”的运转方式。

幼苗期一片叶子做基因分型，就能预测将来果实的糖度和单果重，把选留决策提前好几年——对一年一熟的哈密瓜，意味着育种周期有望从六到八年压到三四年。对糖分这类多年测定成本高、易受环境干扰的性状，基因组选择还有一个额外好处：模型一旦建成，早期世代可以只测基因型、不测表型，把宝贵的果实测定留给少数最优秀的候选品系，表型资源的使用效率因此倍增。

另一条值得注意的联动是基因组选择与高通量表型组的结合。前文说表型鉴定是训练数据的地基，而无人机遥感、高光谱成像等表型组技术正在把”地基”拓宽：单株的冠层温度、叶绿素含量、生物量估测都可以低成本批量获取，其中一些间接指标与糖分、长势相关。把这些中间表型纳入基因组选择模型，一方面可扩充训练数据规模，另一方面为”先测易测的、推算难测的”提供了统计通道。当然，间接表型与目标性状的相关程度需要逐年校验，模型中不能拿来就用，但方向上它代表了基因组选择与智能表型的深度融合趋势。

当然，建模之初要同时积累基因型和表型数据，头几年”只见投入、不见产出”，换群体、换环境模型往往还需重新校准，把它理解为长期投入的育种基础设施更接近实际。对哈密瓜育种机构而言，可行的启动方式是：先在现有骨干亲本及其分离后代中建立小规模训练群体，选择一两个核心性状（如SSC）做示范，跑通流程、积累经验后再逐步扩展。基因组选择与MAS也并不互斥——主效抗病基因用MAS盯住，数量性状交给基因组选择模型，两套体系并行运转，才是当前育种实践的完整图景。

4.6智能设计育种

标记、组学、编辑、基因组选择各自解决一段问题，而育种决策需要把所有信息拼成一张完整的图。智能设计育种指的就是这种集成形态：把改良目标分解为理想基因型的组合，再用数据模型倒推所需的亲本选配与选择方案。它与其说是第六种技术，不如说是前几种技术与数据、算法的总集成。

4.6.1概念与内涵

概念：

• 整合基因组、表型组、环境组数据

• 人工智能辅助育种决策

• 全基因组设计：理想基因型构建

其逻辑并不神秘：品种就是一套基因型，环境决定基因型如何表达，把三方面数据整合建模，就可能预测任一杂交组合后代表现的分布，进而挑出最有希望的组合。

对哈密瓜而言，智能设计育种的想象空间是具体而非空泛的。设想一个场景：育种家面对的目标是把中熟高糖品种的熟性提前到早熟水平，同时保住糖度和网纹品质。传统做法要靠多年经验试配组合；设计育种的路线则是——把控制熟性、糖度、网纹的主效位点和QTL效应录入模型，从种质库中检索携带目标等位变异的材料，模拟不同组合后代的基因型频率和性状分布，选出期望值最高又最少连锁负担的亲本对，田间工作只做验证和微调。这个场景里的每一环（位点效应、等位变异检索、组合模拟）都已有相应技术雏形，缺的是把它们串起来的数据底座和软件工具——这也正是当前智能设计育种建设的重心所在。

“全基因组设计”是这个构想的终点形态——为某个产区的气候土壤条件”定制”一套理想基因型组合，再倒推实现路径。目前阶段，这些预测还做不到百发百中，但方向上的价值已经显现：育种家在实验室里就能比较几十个组合的预期表现，田间只验证最优先的几个，组合评估的效率与命中率同步提升。

4.6.2技术体系与实践路径

要把构想变成可运转的体系，需要四个环节支撑：

技术体系：

1. 数据采集：传感器、无人机、高通量表型
2. 数据整合：多组学数据库
3. 模型构建：深度学习、强化学习
4. 育种决策：最优杂交组合设计

四个环节环环相扣，也各有难点：表型采集长期是短板，测几万株果实性状仍靠人，传感器和无人机正在补课；数据整合要求多组学数据库标准化，格式不统一、元数据缺失是各育种单位的通病；模型构建依赖算法与育种学知识的结合，单纯堆算法而不懂性状遗传规律，模型再花哨也难有实用价值；而最终拍板的仍是育种家——模型提供选项和依据，不是决定。

为使全章脉络一目了然，表4-2对本章所涉各技术体系的定位与相互关系作一小结。可以看到，从MAS到智能设计育种，各技术并非简单的替代关系，而是在育种流程的不同环节各就其位。

从分子标记到智能设计，本章勾画了”识别变异—理解变异—创造变异—系统利用变异”的完整线索。但工具终究服务于目标：对哈密瓜而言，一切技术的落点都是让果实更甜、更香、更好吃。下一章就把镜头对准育种家最关心的对象——品质。

本章参考文献

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思考与讨论

1. RFLP、SSR、SNP、功能标记四类标记分别处于技术演进的什么阶段？若你要为哈密瓜构建一张高密度遗传图谱，会选择哪类标记？为什么？
2. 为什么QTL定位宜采用RIL或DH群体，而快速出结果又常从F2群体入手？若条件只允许建立一个群体，你会如何取舍？
3. GWAS中群体结构导致的假阳性是怎样产生的？混合线性模型通过引入哪些协变量来化解这一问题？试结合哈密瓜种质群体来源多样的特点加以说明。
4. 前景选择、背景选择、重组选择三者在回交转育抗病基因时分别解决什么问题？为什么说”标记连锁不够紧，选择就会走眼”？
5. CmOr基因的图位克隆与基因敲除实验互为印证，这说明了什么？若你计划用基因编辑改良哈密瓜果肉颜色，实验设计的要点有哪些？
6. 哈密瓜糖分性状应优先采用MAS还是基因组选择？请从遗传架构、标记数量、数据成本三方面论证。
7. 影响基因组选择预测准确度的主要因素有哪些？若训练群体与候选群体亲缘关系较远，可能出现什么后果？应如何补救？
8. 智能设计育种的四个技术环节中，你认为对哈密瓜而言当前最薄弱的是哪一环？为什么？表型采集为何被称为短板中的短板？