第十章 生物技术育种

如果说前面各章讨论的传统育种方法是在田间”凭眼力选种”，那么生物技术育种则是把工作的现场搬进了实验室和培养皿。组织培养让一个细胞再生为一株完整的瓜苗，单倍体技术让育种家可以在两个世代之内获得纯合的株系，遗传转化让外源基因能够跨越物种的界限进入哈密瓜的基因组，分子标记则把肉眼不可见的基因型变成了可检测、可追踪的实验信号。这些技术共同改变了育种的基本节奏——许多过去需要等待整个生长季才能看清的性状，如今在幼苗期甚至种子阶段就可以做出判断。对哈密瓜这样生长周期长、杂种后代群体庞大的作物而言，这种效率上的提升尤为宝贵。

不过，技术上的可行与技术上的好用之间还有相当的距离。生物技术育种的每一个环节，都建立在”离体材料能够稳定再生”和”外源遗传操作能够高效递送”这两块基石之上，而哈密瓜恰恰在再生体系的基因型依赖性上吃过不少亏——同一套培养流程，在这个品种上得心应手，换一个品种便颗粒无收。这也是葫芦科作物组织培养研究的一个普遍现象：再生能力是受遗传控制的性状，其表达对基因型高度敏感，没有一个万能的培养基配方可以包打天下。

本章按照从细胞水平到分子水平、再到系统水平的递进顺序展开。11.1节介绍组织培养，包括再生体系的建立、单倍体诱导、原生质体培养与体细胞杂交、体细胞无性系变异等内容，这一节是全书生物技术部分的基础；11.2节讨论遗传转化的方法、受体系统与生物安全评价；11.3节介绍分子标记辅助选择在育种程序中的嵌入方式；11.4节概述基因组编辑技术的整体面貌——其分子细节已在第四章交代，此处侧重它在育种流程中的位置；11.5节展望合成生物学。每一节都力求既讲清原理与流程，也指出各项技术在哈密瓜育种中的应用现状与实际局限。为便于读者对全章技术有一个总体的把握，表10-1先对主要技术体系作一概要比较。

10.1组织培养

10.1.1葫芦科作物组织培养的总体特点

组织培养是所有生物技术育种手段的前置环节。无论是后面要讲的农杆菌转化、原生质体融合，还是突变体离体筛选，第一步都是把植物的细胞、组织或器官放到人工培养基上，让它们重新长成完整的植株。这项技术看似常规，实则对操作者的经验要求很高，因为培养条件差之毫厘，结果可能谬以千里。在进入具体体系之前，有必要先了解葫芦科作物在这一领域表现出的共性规律。

与烟草、拟南芥这类”随取随活”的模式植物相比，葫芦科作物的离体再生明显更”挑剔”。总体而言，其组织培养呈现出几个一般性特点。第一，再生能力存在强烈的基因型差异。同一属内，黄瓜的再生体系建立得较早也较成熟，甜瓜次之，而西瓜、冬瓜等的再生长期受制于基因型瓶颈；在甜瓜内部，不同变种、不同品种之间的反应同样悬殊，这几乎是所有从事葫芦科离体培养研究的实验室都遭遇过的问题。第二，幼嫩组织优于成熟组织。苗龄越短、组织越幼嫩，脱分化和再分化的潜能越高，这也是子叶和下胚轴成为葫芦科最常用外植体的根本原因。第三，培养基组成、激素配比与培养环境之间存在复杂的交互作用，优化往往要经过数十甚至上百组组合的筛选，没有捷径可走。

在培养过程中，有三个问题几乎贯穿葫芦科组织培养的始终，需要在实践中加以防范。

一是褐化。外植体切口处的多酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化聚合，形成褐色物质扩散到培养基中，轻则抑制细胞分裂，重则导致外植体坏死。葫芦科植物体内酚类物质含量较高，这一问题尤为突出。常规的对策包括：选择幼嫩材料以降低酚类底物含量、缩短接种操作时间、在培养基中添加抗氧化剂或活性炭、以及采取”初期暗培养、成活后转光”的策略。多数情况下，褐化并非不可克服，但它决定了转接时机——切面褐化物质积累到一定程度之前，必须及时转移到新鲜培养基上。

二是玻璃化。玻璃化苗表现为叶片肿胀、半透明、质地脆嫩，茎叶含水量异常升高，移栽后极难成活。它的发生与培养基水势过高、乙烯积累、外植体长期处于高湿封闭环境等因素有关。预防的思路是”控湿透气”：适当提高培养基中琼脂浓度或加入渗透调节物质、改善封口材料的透气性、及时开瓶转苗。玻璃化一旦大规模发生，往往意味着培养体系的通气或激素平衡存在系统性问题，应当回溯调整整个方案，而不是仅仅挑除玻璃化苗了事。

三是再生频率与再生植株质量的矛盾。追求高分化率的培养条件常常使再生苗细弱、生根困难；而有利于壮苗的条件又可能压低分化率。实践中通常采取两步走的策略——先在分化培养基上获得尽可能多的不定芽，再把芽切转到低激素或无激素的壮苗生根培养基上，让分化与壮苗各得其所。这一”分化”与”生根”分阶段管理的思想，适用于本章后面讨论的所有再生体系。

在展开各具体体系之前，还应交代无菌培养的起点——无菌苗的建立。一切离体操作都以无污染的材料为前提，而外植体表面消毒的成功率，往往比培养基配方的优化更能决定项目的进度。种子消毒的常规思路是”清洗—表面灭菌—无菌萌发”：先以流水充分清洗，再用适当浓度的次氯酸盐或过氧化氢处理，最后以无菌水洗涤后播入培养基。成熟种子的种皮厚实、带菌量低，消毒耐受性好，这也是葫芦科组织培养多从种子起步的原因之一。对田间采来的幼嫩组织（如花药、幼胚），消毒则要温和得多，预处理与消毒剂的浓度时间组合都需要预试验摸索。培养容器中的污染一旦出现，宁可整瓶淘汰，也不宜”抢救性”转接——带菌材料混入继代体系，损失会成倍放大。

10.1.2外植体选择与再生途径

建立任何一个再生体系，一切从选择合适的外植体开始。

外植体选择：

• 子叶、下胚轴、真叶

• 花药、胚珠、原生质体

哈密瓜的组织培养中以子叶和下胚轴最为常用，原因是它们取材方便、分化能力强，尤其是萌发后数天的幼嫩子叶近轴端，往往能获得较高的不定芽分化率。真叶的再生能力稍弱，但适合做某些以叶片为受体的转化实验。至于花药和胚珠，用途则明显不同——花药培养旨在通过单倍体途径快速获得纯合系（详见11.1.5），胚珠培养主要用于远缘杂交中幼胚的拯救，原生质体则是体细胞融合和瞬时表达实验的材料（详见11.1.6）。同一类组织，研究目的不同，取材时期和培养方案可能完全两样，这是初学者容易忽略的地方。

外植体接种之后，沿着两条不同的路径再生为植株。

再生途径：

• 器官发生：直接、间接

• 体细胞胚胎发生

直接器官发生是外植体上直接分化出芽，不经愈伤组织阶段，周期短、嵌合体风险小，但扩繁系数有限；间接器官发生则要先经过脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出芽，增殖量大，可愈伤培养时间越长，体细胞变异积累得越多（详见11.1.7），这一点在用于快繁时必须警惕。体细胞胚胎发生是另一条路线——体细胞像合子胚那样经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚等阶段发育成胚，进而长成完整植株。单个体细胞胚通常来源于单个细胞，嵌合体少，而且胚状体可以大量同步化生产，在人工种子等方向上颇具潜力。选择哪条途径，取决于后续用途：快繁与脱毒多取直接途径，大量扩繁与遗传转化则常依赖间接途径或体胚系统。

10.1.3哈密瓜子叶与下胚轴再生体系的一般思路

子叶和下胚轴之所以成为哈密瓜再生体系的两大支柱，除了分化能力强之外，还有一个现实的原因：无菌苗易于大量获得。种子表面消毒后播于无糖或低糖培养基上，一周之内即可提供数量充足的幼嫩外植体，且不受季节限制。围绕这两类外植体，建立再生体系的思路是大体相通的，可以概括为四个环节。

第一步是外植体制备。选取成熟饱满的种子，经表面消毒后接种于萌发培养基，控制光照与温度使下胚轴粗壮、子叶展开而未老化；随后切取子叶的近轴端片段或下胚轴的中上段作为外植体。切取的部位和方向对分化反应影响很大，一般而言，靠近维管束极性端、包含分生潜力细胞的片段反应更好，这也是许多报道中”近轴端朝上”接种方式的原因。

第二步是诱导分化。将外植体置于含适量生长素与细胞分裂素的分化培养基上，两类激素的浓度比是决定发育方向的核心开关——细胞分裂素占优势时倾向于出芽，生长素占优势时倾向于生根或形成愈伤。具体到某个品种，最适配比只能通过实验摸索，文献中报道过的有效组合很多，但直接照搬往往效果不佳，原因就在于基因型的差异。比较稳妥的做法是参考文献中同类品种的框架条件，围绕其浓度中心做小范围的正交试验。

第三步是芽的增殖与伸长。分化出的不定芽通常细小密集，需要切转至增殖培养基上继续增殖，再转入降低细胞分裂素浓度的伸长培养基，让芽抽生展开。增殖与伸长阶段的比例调配，直接决定了单位时间的成苗量。

第四步是生根与驯化移栽。将健壮的无根苗转入生根培养基诱导根系发生，生根后的小苗经炼苗——逐步降低湿度、增强光照——再移入基质。移栽环节的失水与烂根是再生苗损失的”最后一段路”，湿度梯度的平缓过渡比任何”特效药剂”都更管用。

需要强调的是，上述流程只是”一般思路”，每个环节的具体参数都必须针对所用品种重新验证。正因为如此，凡是计划开展遗传转化或单倍体培养的育种单位，无不把目标品种（而非模式品种）的再生体系建立作为立项后的第一项工作；再生体系一旦打通，后面所有生物技术操作才有立足之地。

实践中总结起来，再生体系建立的失败原因主要集中在几处：外植体苗龄不当，幼嫩度差一个数量级，反应可能天差地别；激素配比照搬文献而不结合本品种的实际反应，常常整体偏移；继代时机把握失当，愈伤褐化后才转接，回天乏术；以及最容易被忽视的一点——培养室的季节性温度波动与光照不均，使同一方案在不同批次间结果不稳。因此，规范的操作记录（批次、苗龄、配比、反应率）是再生体系研究中比”秘方”更重要的资产，有了系统的记录，优化才有方向可循。

10.1.4组织培养在哈密瓜育种中的应用

组织培养在哈密瓜育种中的价值，可以从以下几个方面来理解。

应用：

• 快速繁殖

• 脱毒苗生产

• 突变体筛选

• 遗传转化

快速繁殖解决的是”好材料如何快速铺开”的问题。一个优良株系通过丛生芽增殖，一年之内即可获得成千上万株无性后代，远非种子繁殖可比；对于制种亲本的快速扩繁、新组合的快速中试，价值尤为直接。脱毒苗生产的原理是病毒在植物体内分布不均，茎尖分生区病毒浓度极低，切取微小茎尖培养即可获得去病毒植株——这对长期连续自交、病毒逐代积累的亲本材料尤其重要；脱毒后的种苗生长势恢复、产量品质回升，在甜瓜嫁接栽培与集约制种地区已有实际应用。突变体筛选把培养与诱变结合起来，在细胞水平施加选择压（如培养基中添加病菌毒素或盐分），存活下来的愈伤即可能是抗性变异体，省去了田间逐株筛选的大量工作，其可行性与局限将在11.1.7详细讨论。至于遗传转化，则要有稳定的再生体系作为受体基础——这也再次说明，再生体系是整个生物技术育种链条中最先要打通的一环。

10.1.5花药培养与单倍体育种

常规杂交育种中，杂种后代要经过连续多代自交才能趋于纯合，系谱法通常需要六个以上世代。单倍体育种提供了一条”捷径”：通过花药培养等途径获得单倍体植株，再经染色体加倍，一步得到遗传上完全纯合的双单倍体（doubled haploid，DH）系。纯合过程从六七个世代压缩到两个世代（单倍体一代加加倍一代），选择效率因此大大提高——所有隐性性状在DH系中即刻显现，没有杂合掩盖的问题。

获得单倍体的途径不止一条，各种途径的比较见表10-2。

花药培养是应用最广的途径。取材时期是成败的关键——小孢子发育处于单核靠边期时雄核发育潜能最高，过早或过晚反应都急剧下降；由于花药外部形态与内部小孢子发育期并非严格对应，接种前需要镜检确定适宜的取材标准。培养先诱导出胚状体或愈伤，再生为单倍体或自然加倍的双倍体植株，再用秋水仙素等试剂人工加倍，获得可育的DH系。未授粉子房培养则从雌配子体一侧获得单倍体，可与花药培养互为补充；辐射花粉授粉利用染色体消除原理诱导孤雌生殖，得到的单倍体胚往往需要及时进行胚拯救才能成苗。

DH系在遗传研究和育种中的价值体现在两个层面。在育种层面，DH系就是即取即用的纯系，可直接进入配合力测定和组合选配，不仅省去多代自交的时间，还使早代选择的准确性显著提高；对哈密瓜这样世代周期长、夏秋两季制种条件苛刻的作物，每缩短一个世代都有实在的经济意义。在研究层面，DH群体是构建分子遗传图谱的理想材料——群体内各株系基因型完全纯合、可无限繁殖、多年多点重复使用，第四章讨论的QTL定位和许多标记开发工作，正是建立在DH或重组自交系这类永久群体之上的。事实上，甜瓜参考基因组所用材料DHL92本身就是由DH系衍生而来，单倍体技术对甜瓜基因组学的奠基作用由此可见一斑。

不过也要清醒地看到，哈密瓜乃至整个甜瓜属的花药培养至今未能达到烟草、油菜那样的高效率：出胚率低、白化苗和畸形胚比例高、品种间差异悬殊，这些问题使单倍体技术在哈密瓜育种中仍处于”能用而不易用”的状态。提高反应效率的探索集中在供体植株的生理状态、预处理方式、培养温度与碳源种类等方面，但基因型瓶颈并未根本突破。可以预期，随着雄核发育机理研究的深入和小孢子培养体系的改进，这一状况会逐步改善；在那之前，DH系更多是以”特定品种的有限产出”参与育种，而非全面铺开的常规手段。

DH系进入育种程序后，还有一个值得注意的技术细节：单倍体加倍过程使用的化学试剂对细胞有毒性，部分加倍处理可能伴随染色体结构变异或基因型筛选效应，因此DH系的田间表现并非完全等同于常规自交固定后的纯系。严谨的做法是让DH系先经历一两个世代的自交繁殖与初步观察，确认没有明显的异常后再投入配合力测定。此外，DH系一旦获得即可无限繁殖的特性，使多环境、多年度的表型重复鉴定变得经济可行——同一套基因型材料分发给不同试验点同步评价，表型数据的精度大大优于逐年逐代繁殖的分离材料，这正是DH群体在QTL定位中格外受青睐的另一个原因。

10.1.6原生质体培养与体细胞杂交

用酶解的方法去掉细胞壁，便得到裸露的原生质体。原生质体是植物细胞工程中最”底层”的材料：它既能通过培养再生为完整植株，又能在理化条件下实现两两融合，从而把两个亲本的全部或部分遗传物质合并到一起——这就是体细胞杂交，也称原生质体融合。与有性杂交相比，体细胞杂交可以绕过生殖隔离，甚至实现细胞质基因（线粒体、叶绿体基因组）的重组与转移，这是常规杂交做不到的。对哈密瓜育种而言，它理论上提供了一条把近缘野生种或异属材料的抗性导入栽培种、而无需多代回交的途径。

理想虽好，现实却相当骨感。原生质体技术在哈密瓜上面临的困难层层叠加：首先，获得大量活力良好且能持续分裂的叶肉原生质体本身不易——葫芦科叶片的酶解条件苛刻，原生质体分裂启动慢；其次，原生质体再生植株的难度远高于一般的组织培养，迄今在甜瓜属内成功再生的报告屈指可数，异种间的融合细胞再生更是难上加难；第三，即便再生成功，融合后代的遗传行为也极不稳定，染色体随机丢失、细胞质基因组分离等问题使得融合后代在育种上难以直接利用，往往还要经过多年的回交筛选。

因此，体细胞杂交目前更多是作为机理研究与非对称融合技术的探索平台存在。所谓非对称融合，是先用辐射处理供体原生质体使其染色体断裂，再与受体融合，从而只转移少量供体遗传物质的策略；它在其他作物上已有成功导入抗病性的先例，被普遍视为葫芦科体细胞杂交最可能先行突破的方向。总体判断是：对哈密瓜育种者而言，原生质体培养与体细胞杂交在可预见的时期内还不是主力技术，但跟踪这一领域的进展，特别是非对称融合与细胞质替换的可能性，对远缘抗源利用的长期布局是有意义的。

10.1.7体细胞无性系变异与离体筛选

植物经过一轮组织培养再生之后，后代中常会出现供体植株所没有的变异，这类变异被称为体细胞无性系变异。它最初被当作组织培养的”副产品”甚至麻烦，后来人们发现它本身就是一类可资利用的新变异来源：变异谱广、后代稳定快（许多变异单基因控制）、无需诱变处理即可获得，于是在诱变育种之外形成了”细胞水平创种”的一条路子。哈密瓜的快繁与转化工作发展到今天，凡是经历过大量组培苗世代的材料，都应当把无性系变异的监测纳入日程——这既是防范劣变的需要，也是捕捉有利变异的机会。

无性系变异从何而来？来源大体有三：一是外植体原本就携带的体细胞嵌合与预先存在的变异，培养过程只是把它们”放大”了出来；二是组织培养特有的胁迫条件——高浓度激素、延长培养、反复继代——诱发染色体畸变（缺失、易位、多倍化）和点突变；三是转座子的激活，培养条件能使原本沉默的转座元件重新活跃，插入位点附近基因的功能随之改变。这些来源共同决定了无性系变异的方向是不可预测的，需要大规模的后代群体去筛。

与变异创制相配套的是离体选择技术：在培养基中加入选择剂，只让携带目标抗性的细胞和植株存活。抗病方向的典型做法是把病原菌的培养滤液或纯化的致病毒素加入培养基，筛选抗毒素的细胞系；耐盐方向则直接以盐分作为选择压。离体筛选的优点显而易见——数以百万计的细胞在同一培养皿中接受选择，效率远超田间；对毒素致病因明确的病害（如枯萎病这类以镰刀菌酸为重要致病因子的病害），筛选的针对性也较好。

但离体筛选的局限同样必须讲清楚。第一，细胞水平的抗性未必等于植株水平的抗性——离体条件下选择的往往只是细胞对某种单一胁迫因子的耐受，而田间的抗病性还涉及组织结构、诱导防御、发育时期调控等多层面机制，”培养皿里过关”不等于”大田里过关”，最终验证必须回到温室和田间。第二，只有当目标性状能够在单细胞水平表达时，离体筛选才真正有效；对果实品质这类整体性性状，细胞筛选无能为力。第三，长期高选择压下的存活细胞，有些只是生理适应而非遗传改变，继代后抗性消失的情况并不罕见。因此，比较理性的定位是把离体筛选视为一种”高效初筛”手段，用它把庞大的变异群体压缩到可以管理的规模，再由常规程序完成精细评价。

在变异的利用上，有一条被实践反复验证的策略值得推荐：把无性系变异的筛选目标聚焦在”单基因或少数基因控制、便于识别”的性状上，如果皮色泽、株型、抗单一病害等，而回避高度依赖多基因协调的复杂性状。原因在于，组织培养诱导的变异以点突变和小片段变异居多，单基因性状的改良概率相对可观；而对产量这类多基因性状，细胞水平的随机变异几乎不可能带来整体优化。另一条经验是变异材料的”早代压筛”——在再生后的第一代就同步开展目标性状的初步鉴定，有苗头的株系立即进入常规选育程序，无苗头的及早淘汰，避免无性系变异材料在组培瓶中无限继代而丧失活力。

10.2遗传转化

10.2.1转化方法及其适用性

再生体系打通之后，下一个问题是如何把外源基因送进植物细胞并稳定表达，这就是遗传转化的任务。哈密瓜作为葫芦科作物，转化效率整体上仍低于烟草、番茄这类模式植物，方法的选择因此格外讲究。目前可用的转化方法主要有四种。

转化方法：

• 农杆菌介导法

• 基因枪法

• 电击法

• 花粉管通道法

农杆菌介导法是目前哈密瓜转化的主流方法。农杆菌本身就是土壤中一种引起植物肿瘤的病原细菌，育种家反其道而用之：把致病基因换成目的基因，借它的天然侵染机制把T-DNA送进植物基因组。它的优点是插入拷贝数低、边界清楚、操作成本低，缺点是受基因型限制明显，且不同外植体的感受态差异很大——子叶近轴端等分生潜力高的组织既是再生能力的”高地”，也往往是农杆菌侵染的”高地”，两者的重合程度直接决定转化体系能否建立。基因枪法用金粉或钨粉微粒包裹DNA直接轰击细胞，摆脱了对农杆菌宿主范围的依赖，理论上任何基因型都能做，但多拷贝插入和基因沉默的问题更突出，仪器价格也高。电击法主要用于原生质体的瞬时转化，适合快速验证基因功能而非获得稳定转化体。花粉管通道法走的是另一条巧路——授粉后经柱头导入DNA，省去了组织培养环节，操作极其简单，可重复性和机理上的确定性则一直是争论的焦点，用它得到的材料务必经过严格的分子验证。

农杆菌介导法之所以能在葫芦科站住脚，与对侵染机理认识的深入密不可分。农杆菌感染植物时，会把T-DNA从Ti质粒转移并整合到植物核基因组中，这一过程需要vir基因在被侵染植物的酚类信号激活后启动； bruises 或幼嫩伤口处分泌的乙酰丁香酮类物质正是天然的诱导剂，因而在共培养培养基中添加这类酚类化合物、调节共培养的时长与温度，成为提高转化效率的常规手段。侵染的”火候”同样讲究——菌液浓度过低转化率不足，过高则外植体受细菌过度生长之害而褐变死亡，共培养结束后彻底除菌更是防止后期烂染的关键一步。这些环节环环相扣，任何一个失守都会让整批试验前功尽弃，也正因如此，农杆菌转化被戏称为”一半是科学、一半是手艺”的工作。

10.2.2受体系统与转化途径概貌

任何一种转化方法最终都要回答同一个问题：外源DNA进入细胞之后，如何变成一株携带该基因的可育植株？这就把转化与再生紧紧捆绑在了一起。转化受体系统大体可分为三类：一是以子叶节、下胚轴等外植体为代表的直接分化系统，外植体先经侵染、共培养，再直接进入分化选择，路线最短，是葫芦科最常用的模式；二是以愈伤组织或悬浮细胞为受体的间接系统，增殖量大、便于施加选择压，但体细胞变异风险随之而来；三是以原生质体为受体的系统，转化效率高（尤其是电击和PEG介导），受制于再生困难，多用于瞬时表达研究。

一个完整的稳定转化流程，无论受体系统如何，都包括这样几个阶段：外植体预培养使其处于感受态、农杆菌侵染与共培养、除菌与恢复培养、选择培养基上的抗性芽筛选、生根与移栽、以及分子鉴定。其中选择标记的使用浓度和时机是常见的”翻车点”——压得太早，再生被彻底抑制；压得太晚，假阳性泛滥。分子鉴定则要回答三个递进的问题：基因进来了没有（PCR检测外源序列），整合得规不规范（拷贝数分析），有没有真正发挥作用（表达量与表型验证）。三关都过，才算获得一个真正意义上的转化事件。

还应当了解，随着基因编辑技术的兴起，”转化”的内涵正在扩展——转化的载体未必携带外源目标基因，而可能只是携带编辑工具；获得编辑材料后，通过后代分离把编辑工具序列筛除，最终产品中可以不含任何外源基因。这类以”递送”为定位的瞬时转化需求，正在推动哈密瓜转化体系向更高效、更简便的方向改进，相关技术定位可参考第四章和11.4节。

关于选择标记还有一点需要交代。早期转化体系普遍依赖抗生素或除草剂抗性基因作为选择标记，但这些标记基因是否随最终产品释放、是否带来环境与食品安全层面的争议，长期是公众关注的焦点。为此，标记基因剔除技术逐渐发展起来，如共转化—分离策略：把目的基因与标记基因分别置于不同的T-DNA或独立位点，通过后代遗传分离获得只含目的基因、不含标记基因的植株；此外还有位点特异性重组剔除等方案。这些技术使”无标记转基因材料”的获得成为常规操作，虽然多花一两个世代的分离筛选，但在安全评价和市场沟通上换取的主动权是值得的。

10.2.3转化基因与育种方向

转入什么基因，取决于育种目标。

转化基因：

• 抗病基因：Pm-1、Fom-2

• 品质基因：CmOr、CmSUS

• 抗逆基因：DREB、NHX

抗病方向转入的是主效抗性基因，如抗白粉病的Pm-1和抗枯萎病的Fom-2，这类基因效应明确、表型直观，是转化验证的理想对象。品质方向的CmOr和CmSUS分别控制β-胡萝卜素积累和蔗糖代谢，直接指向哈密瓜最重要的商品性状。抗逆方向常用的DREB是一类转录因子，它能同时启动多个逆境响应基因，一片”总开关”带动下游一片；NHX则编码液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，把进入细胞质的钠离子区隔到液泡中，是耐盐工程的经典靶点。值得注意的是，转录因子类基因的过表达常伴随时育期推迟、植株形态异常等副作用，实践中的分寸拿捏——用什么启动子、表达量控制在什么水平——往往比基因本身更考验设计功力。

归纳起来，遗传转化在哈密瓜育种中的落点主要有三。

应用：

• 抗病育种

• 品质改良

• 抗逆育种

这三个方向正好对应了前面各章讨论的三大育种主题，可见遗传转化并不是独立于常规育种之外的另一套体系，而是同一目标在分子层面上的实现方式。也要客观地承认，转基因哈密瓜至今并未大面积商业化，技术之外的法规审批、公众接受度和市场因素，同样在决定一项技术能走多远。育种家能做的，是先把技术储备做好，让材料经得起将来任何政策窗口的检验。

10.2.4叶绿体转化与生物安全评价

在核基因组转化之外，还有一条重要的技术路线是把外源基因定点整合到叶绿体基因组中，即叶绿体转化。叶绿体基因组小而高度保守、拷贝数多，转化表达量通常远高于核转化；同源重组介导的定点整合使外源基因的位置效应和沉默问题大为减轻；更受关注的是它在生物安全上的天然优势——叶绿体在多数作物中呈母系遗传，花粉中几乎不含叶绿体，外源基因随花粉漂移的风险因此大大降低。对于像哈密瓜这样与近缘野生种、其他甜瓜品种混种且虫媒授粉频繁的作物，这一特性在环境安全评估中的分量不言自明。叶绿体转化的瓶颈在于转化技术本身：基因枪轰击是目前主要的递送手段，建立体系的工作量大，目前主要在烟草等模式植物上成熟，作物中的成功案例仍集中在少数几种。葫芦科叶绿体转化尚处于探索阶段，但其技术逻辑值得每一位关注长期布局的育种者了解。

无论核转化还是叶绿体转化，任何转基因材料走向应用都必须通过生物安全评价，这不是技术问题而是制度要求。我国的转基因生物安全管理实行分级分阶段评价与许可制度：研究阶段须在具备条件的实验室按安全等级开展，中间试验、环境释放、生产性试验逐级审批，每一级都要积累对生存竞争能力、基因漂移、对非靶标生物与生态系统影响、食品安全性与环境安全性等问题的数据；品种审定之前，还要完成食用安全和环境安全的全套检测。对育种者而言，有两点务必牢记：其一，未经审批的转基因材料不得释放到田间和制种体系，试验材料的隔离与监管责任在项目承担单位；其二，评价是分阶段的漫长过程，从实验室到品种通常以数年计，任何转化育种计划都应把这一时间维度纳入规划。生物安全评价看似是”关卡”，实则是转基因技术获得社会信任的前提——制度框架越明确，技术储备的最终价值才越有保障。

10.3分子标记辅助选择

分子标记辅助选择（MAS）是当前哈密瓜育种中应用最成熟、性价比最高的分子技术。它的基本思想很朴素：既然性状的基因型可以通过分子标记检测，那就不必等到性状表达出来再作选择——苗期取一小片叶子，提取DNA，跑一管PCR，便能知道这株苗带没带目标基因。对于抗病性鉴定这类需要接病原、发病条件还未必配合得上的工作，MAS的省时省力是肉眼可见的。标记类型、标记开发的技术细节已在第四章系统介绍，本节聚焦于MAS如何嵌入育种程序。

10.3.1MAS的完整流程

一套完整的MAS工作，大体要经过五个环节。

MAS流程：

1. 标记开发
2. 群体构建
3. 标记筛选
4. 前景选择
5. 背景选择

这五步环环相扣，缺一不可。标记开发是起点，要依据已克隆的基因序列或定位的QTL区间设计引物，理想标记应当与目标基因紧密连锁甚至直接位于功能位点上；标记与基因靠得不紧，重组会让选择”脱靶”，这是MAS失败最常见的原因。群体构建提供检验标记的材料，作图群体或分离群体皆可。标记筛选则是对候选标记做检验，确认它在目标群体中的多态性和准确性，只有解释大部分表型变异的标记才值得用于大规模选择。前景选择是看后代个体是否携带目标基因，背景选择则看其遗传背景中轮回亲本基因组的恢复比例——回交育种中两者并用，才能做到”只搬基因，不带累赘”。很多团队只做前景选择就宣布成功，结果育成的材料带着抗性基因，也带着一堆不良性状，这样的教训并不少见。

在育种程序层面，MAS的嵌入点主要有三处。一是回交转育中的”前台选择＋背景扫描”，把传统的4～6代回交缩短到2～3代，且每代都能客观量化恢复进度；二是早代混合群体中的目标基因富集，在F2或F3群体中先用标记筛掉不带目标基因的个体，大幅压缩后续田间评价的规模；三是亲本选配中的基因型档案管理，把骨干亲本的抗病基因型、品质位点基因型建成数据库，组配时按互补原则直接检索，避免重复鉴定。这三处嵌入点有个共同特征：MAS并不取代田间选择，而是把田间选择的”入口”提前到基因型层面。

第二处需要提醒的是标记检测本身的实验室质控。MAS的判断完全建立在PCR等分子检测的基础上，一次加样错误、一次气溶胶污染、一批失活的酶，都可能让大量个体的基因型判读出错，而育种者往往并无察觉。规范的做法包括：每批检测设置阳性和阴性对照，关键世代的目标个体做重复检测，标记分型结果与少量个体的田间表型做定期核对——一旦发现分型与表型系统性对不上，就应当回头检查标记的可靠性和实验流程。把MAS当作”黑箱”使用而放弃质控，是新手团队最常见的系统性风险。

10.3.2应用案例与适用边界

哈密瓜育种中已有若干MAS的应用实例。

应用案例：

• Fom-2基因的MAS

• Pm-1基因的MAS

• SSC的MAS

Fom-2和Pm-1分别抗枯萎病和白粉病，都是主效显性基因，标记与基因的关系明确，是MAS最拿手的情形；尤其对隐性抗性基因或苗期无法鉴定的性状，MAS更是不可替代——显性基因的杂合携带者表型上与纯合体无法区分，没有标记辅助，其育种利用要多花整整一个世代的测交验证。SSC的MAS则代表了另一类难度更高的应用——可溶性固形物含量是典型的数量性状，由多个QTL共同决定，单个QTL的效应有限，聚合多个QTL才能看到可观的改良。这类应用需要更精细的标记体系和更大的选择群体，成本也随之上升。

实践中的一条经验是：主效基因用MAS，事半功倍；微效QTL用MAS，要算好经济账。标记开发的投入是否值得，最终要看目标性状的田间鉴定成本和育种规模——抗病接种鉴定年年要做、成本高且受发病条件制约，MAS替代的收益立竿见影；而数量性状的效应会因遗传背景和环境而漂移，标记预测力衰减，复核的成本可能吃掉全部节省。此外还应看到，随着全基因组测序普及和基因分型成本下降，MAS正从”单标记、单性状”走向”多位点、全基因组”的模式，基因组选择把全基因组上的标记信息整合为个体育种值的预测，可以视为MAS逻辑的自然延伸，其方法体系已在第四章详述，第十一章还将结合智慧育种平台进一步讨论。

围绕SSC这类数量性状的MAS，还有一条降低成本的现实路径值得一提：不必追求”每个世代、每个个体全位点检测”的理想状态，而可以在早代只对效应最大的主效QTL做前景筛选，把群体规模压下来之后，再在缩小的群体中对其余QTL逐轮补充检测。选择压的”分层施加”虽然比一次性全检多花一个世代，但检测总量和成本明显下降，对以实用为目的的育种项目往往更为划算。数量性状MAS的方案设计，说到底是在遗传收获、世代进度与检测成本三者之间找平衡点，没有唯一正确答案，只有针对具体项目条件的合理取舍。

10.4基因组编辑

10.4.1技术概貌与工作流程

如果说MAS是在现有变异中”挑好的”，基因组编辑则是直接”制造好的”。以CRISPR/Cas9为代表的编辑技术，让育种家第一次可以像修改文字那样，对基因组进行定点、精确的改动，而且可以不引入外源基因——这在法规和公众接受层面都是巨大的优势。CRISPR/Cas9系统的构成、靶点设计规则、碱基编辑与引导编辑等变体技术，第四章已经作了系统介绍，本节着重从育种应用的角度把握其整体流程与定位。

CRISPR/Cas9系统的工作流程可以概括为四步。

CRISPR/Cas9系统：

• 靶基因设计

• 载体构建

• 遗传转化

• 突变体筛选

靶基因设计阶段要在目标基因上寻找合适的sgRNA位点，理想的靶点应位于基因的功能结构域、外显子前端，并尽量避开脱靶风险高的区域；设计是否周全，直接决定后续工作量。载体构建把sgRNA和Cas9表达框组装进同一载体，如今已有成熟的骨架系统，操作难度大大下降。遗传转化沿用的仍是11.2节介绍的技术路线，农杆菌介导法是主流，这也再次凸显了高效再生体系的基础地位——编辑技术再精巧，没有转化受体一切都是空谈。突变体筛选通过PCR扩增靶位点测序鉴定，纯合突变株可直接用于后续育种，杂合株则要继续自交分离。整个过程周期不长，从设计到获得纯合突变体，通常几个世代之内即可完成，远快于传统的回交转育。

编辑后代的遗传管理也有一套章法。T0代转化植株的靶位点通常是杂合或嵌合状态，需要自交使突变分离，从中挑选纯合且不含载体序列的后代；若导入的突变是纯合致死的，还应考虑保留杂合体并作遗传鉴定。对于以营养繁殖保存的材料，嵌合体的存在更要警惕——芽的分生组织中突变细胞与未突变细胞混杂，传代后可能重新分离出野生型枝条，因此需要通过单芽继代和子代检测来固化突变。这些操作不涉及高深的理论，却决定了一个编辑项目最终的产出是”几株苗”还是”一个可用材料”，细心的遗传跟踪贯穿始终。

10.4.2在哈密瓜中的应用方向

就哈密瓜而言，基因组编辑目前主要在以下方向发力。

应用：

• 品质改良：CmOr、CmSUS

• 抗病性增强：Pm-1、Fom-2

• 抗逆性增强：DREB、NHX

品质方向的靶点最为成熟。CmOr是控制β-胡萝卜素积累的主效基因，敲除后果肉颜色由橙转白，这说明该基因的功能位点明确、表型判读直观，是验证编辑体系的理想靶标；更有价值的是通过编辑调控元件或启动子来精细调节表达量，实现”橙色加深”这类正向改良。CmSUS则牵动整个蔗糖代谢网络，编辑它对含糖量的影响需要更谨慎的评估。抗病与抗逆方向的情况类似——编辑途径已经打通，真正稀缺的是经过充分验证的、效应明确且无副作用的靶点。

此外，编辑技术还有一类容易被忽视的用途：反向验证基因功能。候选基因的功能确认通常要花数年时间，而编辑技术把”敲除—观察表型”压缩到几个月，这反过来加速了新靶点的发现。换句话说，基因组编辑既是育种的直接工具，也是靶点研发的加速器，两个角色互相滚动——功能研究滞后一天，编辑育种的靶点选择就多一天的盲目，而编辑手段本身正在缩短这个滞后期。

10.4.3与第四章的分工及与常规技术的衔接

本章对基因组编辑采取”概貌为主、细节回指”的处理方式，是为了避免与第四章的内容重复：编辑酶系统的分子机理、碱基编辑与引导编辑的技术谱系、脱靶效应的检测与规避等，请读者回到第四章查阅；本章关心的是编辑技术在育种流程中的位置。这个位置可以概括为一句话——基因组编辑的上游是靶点知识（来自第二章的遗传基础与第四章的基因克隆），中游是11.2节的遗传转化与11.1节的再生体系，下游则是第八章的育种程序：编辑得到的突变体同样要经历品种比较、区域试验和审定的全过程。编辑技术的加入改变的是”创造变异”这一环节的效率和精度，而没有、也不可能绕过品种育成的其余环节。认识到这一点，才能对”编辑育种颠覆传统育种”之类的说法保持清醒。

从法规演进的动态看，基因编辑产品的监管定位是当前全球关注的焦点。由于基因组编辑可以做到不引入外源序列，其最终产品与自然突变或传统诱变的结果在分子层面难以区分，许多国家正在或已经为这类产品设立区别于传统转基因的、更为简便的管理路径；我国也发布了针对基因编辑植物的农业用基因编辑植物安全评价指南，为不携带外源基因的编辑材料开辟了专门的申报通道。这一制度动向对育种实践的启示是：在开展编辑育种时，就应当有意识地规划”无外源基因”的产品路线——选择可遗传的纯合突变体、通过分离世代剔除编辑载体、保留完整的系谱与分子证据——为将来按更轻量化的程序进入品种审定预留空间。法规与技术始终在互动，盯紧政策窗口，技术储备才能在最恰当的时机兑现。

10.5合成生物学

10.5.1概念与核心思想

合成生物学是本章视野最新的一个方向，也是生物技术育种从”利用自然”走向”设计自然”的标志。它不再满足于改造单个基因，而是试图按照工程学的设计理念，把基因、启动子、调控元件像电子元件一样组装起来，在生物体内构建出自然界原本不存在的人工系统。

合成生物学的核心思想可以概括为三点。

概念：

• 设计人工基因线路

• 合成新代谢途径

• 创造新性状

人工基因线路是让一组基因在预设的逻辑（与、或、非门）控制下协同表达，响应特定的信号开关；合成新代谢途径则是把散布在不同物种中的酶基因重新编排，打通一条原本不存在的代谢流水线；两者结合起来，就有可能赋予作物全新的性状——不是改良”有”的东西，而是创造”没有”的东西。这套思路在微生物中已经相当成熟，青蒿素前体的人工合成即是标志性成果，但移植到高等植物、尤其是长期选育的园艺作物上，难度要大得多：植物的多细胞组织结构与发育程序，使得基因线路的”布线”远比单细胞生物复杂。

从研究流程看，植物合成生物学的开展大体遵循”设计—构建—测试—学习”的循环：先依据代谢网络的知识在计算机上设计目标途径与基因线路，再逐段构建并组装遗传元件，转入底盘材料测试表达与代谢通量，根据测试结果修正设计，如此迭代。这一工程化的循环借鉴自合成化学与软件工程，其效率高度依赖标准化元件库和高通量测试平台的建设——前者让元件可以像积木一样拼装复用，后者让每一轮迭代的成本降到可以承受的水平。目前这两块基础设施在植物领域仍远不如微生物成熟，这也是植物合成生物学整体上慢半拍的症结所在。

10.5.2应用前景与定位

就哈密瓜育种而言，合成生物学可能率先在以下领域显出价值。

应用：

• 人工合成香气物质

• 人工合成营养成分

• 人工设计抗病基因

香气物质的代谢途径相对短小、模块化程度高，通过在果实中异源重构酯类合成途径来强化特异香型，是近期最有想象空间的方向；第五章的香气育种一节已经列出了酯类、醇类、醛类代谢的关键酶基因，它们正是合成途径设计的现成”元件库”。营养成分方面，类胡萝卜素、维生素C等代谢网络已有较清楚的图景，提升途径通量或引入新的终产物都是可行的设计目标。人工设计抗病基因则更为前沿——借助对病原识别机制的理解，定向改造抗性蛋白的识别谱，使其应对更广的生理小种，甚至从头设计全新的识别元件，这对抗性基因轮换和持久抗性构建（参见第六章）具有潜在的战略意义。当然，这些都还处于探索阶段，离实际品种尚有距离。把它们放在本章末尾，与其说是介绍成熟技术，不如说是提醒读者：生物技术育种的边界，正在被不断向外推。

回顾全章，组织培养提供受体与再生的平台，单倍体技术压缩纯合进程，无性系变异与离体筛选开辟细胞水平的变异来源，遗传转化和基因组编辑完成遗传物质的定向操作，MAS把分子信息转化为选择效率，合成生物学则预示着从改造到设计的跨越。这些技术彼此衔接、层层递进，共同构成现代生物技术育种的完整链条（表10-1的概览可再回顾一遍以形成整体印象）。但也应当清醒：任何一项技术的威力都要通过与常规育种的结合才能兑现，实验室里的成功与田间的优良品种之间，仍然隔着多年多点的考验。把分子手段嵌入而非取代传统育种程序，是生物技术育种走向实用的必由之路，也是后续智慧育种章节将要展开的逻辑起点。

还应当从全书的高度认识这些技术之间的”配套”关系。单倍体技术产出的DH群体是分子标记研究与基因组选择的数据基础；再生体系既是遗传转化的前提，也决定了基因编辑能否落地；无性系变异与离体筛选补充了常规诱变的不足；而转化与编辑获得的新材料，最终要通过第八章的育种程序接受检验。可见本章并非五个孤立技术的罗列，而是育种技术体系的一条”横向纽带”——它把第二章的遗传理论、第四章的分子工具和第四、六至九章的育种方法连接成一个可以运转的整体。学习本章时，建议读者随时回溯这些关联，把每一项技术放到育种全流程的坐标上定位，这比孤立地记忆操作细节重要得多。

本章参考文献

Garcia-Mas J, et al. (2012) The genome of melon (Cucumis melo L.). PNAS, 109(29): 11872-11877.

Pitrat M (2017) Melon. In: Vegetables I. Springer, pp 209-239.

张明方，等 (2018) 甜瓜遗传育种学. 中国农业出版社.

新疆农业科学院 (2020) 新疆哈密瓜品种志. 新疆科学技术出版社.

王建设，等 (2019) 甜瓜分子育种. 科学出版社.

刘文革，等 (2021) 西瓜甜瓜育种学. 中国农业出版社.

李国景，等 (2022) 甜瓜基因组学与分子育种. 科学出版社.

陈学好，等 (2023) 葫芦科作物基因组学. 中国农业出版社.

Larkin PJ, Scowcroft WR (1981) Somaclonal variation—a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics, 60: 197-214.

Guha S, Maheshwari SC (1964) In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature, 204: 497.

Daniell H, Khan MS, Allison L (2002) Milestones in chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly era in biotechnology. Trends in Plant Science, 7(2): 84-91.

思考与讨论

1. 为什么说再生体系是哈密瓜生物技术育种链条中”最先要打通的一环”？结合再生能力的基因型依赖性，谈谈建立目标品种再生体系时应当注意哪些问题。
2. 直接器官发生、间接器官发生与体细胞胚胎发生三条再生途径各有什么优缺点？若分别用于快繁脱毒和遗传转化受体，你会如何选择，理由是什么？
3. 花药培养获得单倍体的关键环节有哪些？DH系在缩短育种周期和构建遗传群体两方面的价值分别体现在哪里？为什么说哈密瓜的单倍体技术仍处于”能用而不易用”的状态？
4. 原生质体融合可以转移常规杂交难以利用的遗传物质，为什么它在哈密瓜育种中至今难以实用化？非对称融合被认为是最可能先行突破的方向，原因何在？
5. 体细胞无性系变异的来源有哪些？离体筛选（如抗病细胞系筛选）为什么只能作为”高效初筛”手段？请从细胞抗性与植株抗性的差异角度加以分析。
6. 比较农杆菌介导法、基因枪法与花粉管通道法在哈密瓜转化中的适用情形。一个完整的稳定转化事件为什么要经过”是否进入—是否规范整合—是否表达”三个层次的分子验证？
7. 叶绿体转化在生物安全方面具有哪些天然优势？结合哈密瓜的授粉特性与我国转基因生物安全评价的制度框架，谈谈你对转基因育种材料管理要点的理解。
8. 前景选择与背景选择分别解决什么问题？为什么”只做前景选择”常导致育种失败？结合主效基因与微效QTL两类性状，讨论MAS适用边界与经济性的权衡。